Πώς να επιλέγετε τα ένζυμα περιορισμού

Τα ένζυμα περιορισμού είναι ένζυμα που κόβουν τόσο μονόκλωνο όσο και διπλόκλωνο DNA. Κάθε περιοριστικό ένζυμο έχει μια ειδική αλληλουχία νουκλεοτιδίων, που ονομάζεται περιοχή περιορισμού, που αναγνωρίζει και κόβει. Τα ένζυμα περιορισμού χρησιμοποιούνται για την αλληλούχιση του DNA, την ανάλυση μετάλλαξης και την κλωνοποίηση και ενίσχυση του DNA. Οι επιστήμονες χρησιμοποιούν περιοριστικά ένζυμα για να εισάγουν γονίδια ενδιαφέροντος σε φορείς έκφρασης, μόρια DNA που μπορούν να αναπαράγονται χωριστά από το χρωμοσωμικό DNA. Ο φορέας που περιέχει το γονίδιο ενδιαφέροντος μπορεί στη συνέχεια να εισαχθεί σε ένα βακτηριακό στέλεχος για έκφραση και χαρακτηρισμό πρωτεϊνών.

Βίντεο της Ημέρας

Βήμα 1

Προσδιορίστε τοποθεσίες περιοριστικών ενζύμων στο διάνυσμα σας κοιτάζοντας έναν χάρτη περιορισμού. Ο χάρτης περιορισμού θα σας πει ποια ένζυμα θα μειώσουν τον φορέα σας και πού.

Βήμα 2

Επιλέξτε ένα ένζυμο περιορισμού που έχει επίσης μια θέση που υπάρχει στο ένθετο γονιδίου σας, εξετάζοντας την ακολουθία του ενθέματος. Βεβαιωθείτε ότι η θέση περιορισμού βρίσκεται σε μια θέση στο ένθετο που βρίσκεται εκτός του γονιδίου ενδιαφέροντος, έτσι ώστε να μην χάσετε κανένα μέρος του γονιδίου.

Βήμα 3

Βεβαιωθείτε ότι δεν υπάρχουν διπλότυπα της θέσης περιορισμού οπουδήποτε στο ένθετο ή φορέα γονιδίων σας. Αυτό θα προκαλέσει πολλαπλές περικοπές στο DNA σας και θα σας δώσει παραπλανητικά δεδομένα.

Βήμα 4

Προσπαθήστε να επιλέξετε ένζυμα περιορισμού που κόβουν με κολλητικά άκρα, αντί για αμβλύ άκρα. Οι κολλώδεις άκρες εμφανίζονται όταν το ένζυμο κόβει το διπλόκλωνο ϋΝΑ με κλιμακωτό τρόπο, αφήνοντας μία μονόκλωνη προεξοχή που διευκολύνει την προσκόλληση με μια κοπή ένθετου με αντίθετο τρόπο. Αμβλύ άκρα συμβαίνουν όταν το δίκλωνο DNA κόβεται με ομαλό τρόπο και είναι πιο δύσκολο να συνδεθεί.

Βήμα 5

Επιλέξτε ένα διαφορετικό ένζυμο περιορισμού και για τα δύο άκρα του ένθετου, για να βεβαιωθείτε ότι εισάγεται στο διάνυσμα με τον σωστό προσανατολισμό και για να διασφαλίσετε ότι ο φορέας δεν θα επανασυνδεθεί με τον εαυτό του.

Βήμα 6

Προσπαθήστε να επιλέξετε δύο περιοριστικά ένζυμα που λειτουργούν καλά στο ίδιο ρυθμιστικό σύστημα και τη θερμοκρασία. Εάν αυτό δεν είναι δυνατό, εκτελέστε κάθε πέψη ξεχωριστά.

Τα πράγματα που χρειάζεστε

• Ακολουθία εισαγωγής γονιδίου
• Χάρτης περιορισμού για τον φορέα επιλογής
• Λίστα ενζύμων περιορισμού και των περιοχών τους κομμένα

Συμβουλές

• θέσεις περιορισμού σε αλληλουχία DNA γρήγορα. Ένα τέτοιο πρόγραμμα προέρχεται από την New England BioLabs.